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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4052 (2023) Diesen Artikel zitieren

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E217 ist ein Pseudomonas-Phage, der in einem experimentellen Cocktail zur Ausrottung von mit Mukoviszidose assoziiertem Pseudomonas aeruginosa verwendet wird. Hier beschreiben wir die Struktur des gesamten E217-Virions vor und nach dem DNA-Auswurf mit einer Auflösung von 3,1 Å bzw. 4,5 Å, bestimmt mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). Wir identifizieren und bauen De-novo-Strukturen für 19 einzigartige E217-Genprodukte, lösen die Schwanzgenom-Auswurfmaschine sowohl im gestreckten als auch im kontrahierten Zustand auf und entschlüsseln die vollständige Architektur der Grundplatte, die aus 66 Polypeptidketten besteht. Wir stellen außerdem fest, dass E217 das O-Antigen des Wirts als Rezeptor erkennt, und wir lösen den N-terminalen Teil der O-Antigen-bindenden Schwanzfaser auf. Wir schlagen vor, dass die in diesem Artikel vorgestellten E217-Designprinzipien in PB1-ähnlichen Myoviridae-Phagen der Gattung Pbunavirus konserviert werden, die eine Grundplatte von ~1,4 MDa kodieren, die deutlich kleiner ist als der Coliphage T4.

Der Bakteriophage E217 infiziert Pseudomonas aeruginosa und ist Teil eines experimentellen Phagencocktails, der entwickelt wurde, um P. aeruginosa-Infektionen in Larven der Galleria mellonella (Wachsmotte) und Wirbeltiermodellen auszurotten1,2,3. E217 ist ein PB1-ähnlicher Myoviridae der Gattung Pbunavirus, der durch ein Genom von ca. 66,2 kbp1 gekennzeichnet ist und deutlich kleiner als der klassische Enterobakterien-Phage T4 (ca. 169 kbp)4 ist. PB1-ähnliche Phagen sind auf der Erde allgegenwärtig5 und kommen in Süßwasser in den USA6 und Brasilien7 sowie in Abwasser und Abwässern in Europa8 vor. Diese Phagen haben Genome von ~65 kbs und deutlich einfachere Grundplattenkomplexe als der klassische Coliphagen T4. Ein einzigartiger fünffacher Scheitelpunkt des E217-Kapsids wird von einem langen, kontraktilen Schwanzapparat besetzt, der die ikosaedrische Symmetrie bricht9. Der Schwanz setzt sich an ein dodekamerisches Portalprotein an, das an der einzigartigen Spitze ein Kapsid-Penton ersetzt und dem Virus einen Eintritts- und Austrittskanal zum Verpacken und Auswerfen von DNA10 bietet. Das E217-Genom wird mithilfe von zwei Terminase-Untereinheiten, TerL und TerS, die wir kürzlich charakterisiert haben, in ein unreifes Vorläuferkapsid (oder Prokapsid) verpackt. Gleichzeitig montiert und rekrutiert die Grundplatte das Schwanzrohr, die Hüllenproteine ​​und die Fasern, die durch einen durch zusätzliche Faktoren gebildeten Hals am Portalscheitel befestigt werden.

Die meisten aktuellen Erkenntnisse über den Zusammenbau von Myoviridae werden aus dem Modellsystem T4 extrapoliert, das seit über einem Jahrhundert eingehend untersucht wird12,13,14. Bei Myoviridae ist die Grundplatte ein aus mehreren Untereinheiten bestehender Komplex, der verschiedene Aktivitäten beherbergt, darunter die Bindung an die Wirtsoberfläche, das Eindringen in die innere Membran des Wirts und den kontraktionsgekoppelten Genomauswurf. Die Architektur der isolierten T4-Grundplatte wurde in den Zuständen vor und nach der Kontraktion aufgeklärt, wobei ein Mutant (T4-18am-23am) genutzt wurde, der den gesamten Komplex aus Grundplatte und Schwanzröhre zusammenbaut, ihn jedoch nicht in ein Virion einbaut15, 16. Die T4-Grundplatte ist eine Maschine mit ca. 6 MDa, die aus 15 verschiedenen Polypeptidketten besteht, die in mehreren Kopien wiederholt werden, um einen Molekülkomplex mit ca. 145 Proteinen zu erzeugen. Die T4-Grundplatte hat einen Durchmesser von ca. 490 Å, doppelt so viel wie das bakterielle Ribosom, und enthält sowohl Kurz- als auch Langschwanzfasern, die für die Phagenanheftung an die Bakterienzellwand verantwortlich sind17,18. Hu et al. analysierten T4 in verschiedenen Stadien der Infektion mittels Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET)19. Interessanterweise werden die meisten Langschwanzfasern vor der Infektion gegen das Virion zurückgefaltet und interagieren nicht direkt mit der Wirtsoberfläche. Das erste Ereignis der Schwanzkontraktion ist die irreversible Bindung kurzer Schwanzfasern, die aus der Unterseite der Grundplatte herausragen, an die Außenmembran des Wirts, was die Kontraktion der Schwanzhülle auslöst. Dieses Ereignis treibt das Schwanzrohr in das Periplasma und führt anschließend zum Auswurf des Genoms. Das Durchstechen der Wirtsmembran erfordert keine protonentreibende Kraft, die nur für die Genomtranslokation erforderlich ist.

Es wurde über eine Kryo-EM-Analyse mittlerer Auflösung des Twort-ähnlichen Myoviridae-Phagen phi812 berichtet20. Dieser Bakteriophage enthält eine Grundplatte, die sich deutlich von T4 unterscheidet, wobei die Grundplattenproteine ​​in zwei Schichten parallel zur Bakterienzellwand organisiert sind. Eine ähnliche doppelschichtige Grundplatte wurde auch im Staphylococcus aureus-Phagen SaGU121 gefunden. In jüngerer Zeit wurde die atomare Struktur des R2-Pyocins im Zustand vor und nach der Kontraktion mithilfe der Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse (SPA)22,23,24 bestimmt. Pyocine vom R-Typ sind minimal kontraktile Nanomaschinen, ähnlich den Schwänzen von Myoviridae, denen jedoch ein Phagenkopf und genetische Informationen fehlen. Pyocine vom R-Typ weisen strukturelle Ähnlichkeiten mit den kontraktilen Injektionssystemen der Photorhabdus-Virulenzkassette (PVC) auf, die im Gegensatz zu Pyocinen auf eukaryontische Zellen abzielen können25. Die Kryo-EM-Struktur des R2-Pyocins im Zustand vor und nach der Kontraktion besteht aus 11 einzigartigen Faktoren, die in Hunderten von Kopien wiederholt werden, von denen acht Proteine ​​die Grundplatte bilden. Die R2-Pyocin-Grundplatte ist im Vergleich zur T4-Anordnung minimal, übt aber die gleiche wesentliche Funktion der Wirtsbindung und Signalübertragung aus, um die Schwanzkontraktion und Membranpenetration einzuleiten. Die Pyocin-Arbeit legte nahe, dass die Schwanzfasern seitlich mit der Grundplatte verbunden sind und bei der Rezeptorbindung eine Kaskade von Ereignissen auslösen, die zur Kontraktion der Hülle führen22. Fraser et al. haben diese Idee weiter ausgearbeitet26 und herausgefunden, dass der kontraktile Schwanz eine Aktivierungsenergie von 160 kcal/mol hat und während der Kontraktion eine Kraft von mehr als 500 pNs entwickelt, wodurch die Energie bereitgestellt wird, die zum Eindringen in Membranen erforderlich ist. Die für die R2-Pyocine aufgeklärten Kontraktionsmechanismen gelten wahrscheinlich auch für andere kontraktile Injektionssysteme, wie z. B. Sekretionssysteme vom Typ VI (T6SS) und Phagenschwänze27.

Kürzlich enthüllte eine hochauflösende Kryo-EM-Rekonstruktion des Süßwasser-Myoviridae-Cyanophagen Pam3 die Architektur einer minimalen Myoviridae-Grundplatte, die aus nur sechs einzigartigen Polypeptidketten besteht28. Bemerkenswert ist, dass die Pam3-Grundplatte über Disulfidbindungen kovalent mit zwölf Schwanzfasern vernetzt ist, die sich in einer Aufwärts- und Abwärtskonfiguration abwechseln. In dieser Arbeit beschreiben wir die hochauflösende Struktur des Pseudomonas-Phagen E217, die wir vor und nach der Schwanzkontraktion mittels Kryo-EM visualisieren. Die hier vorgestellten Strukturen geben Aufschluss über die Konformationsdynamik eines kleinen Myoviridae, der in einem experimentellen Phagencocktail verwendet wird, und klären die Proteine ​​und Mechanismen des durch Schwanzkontraktion induzierten Genomauswurfs auf.

Wir verwendeten Kryo-EM SPA, um den ikosaedrischen Kapsid- und Schwanzapparat E217 sichtbar zu machen (Abb. 1a). Mit dem Ziel einer hochauflösenden Rekonstruktion des Schwanzes im gestreckten und kontrahierten Zustand haben wir zwei große Datensätze (~44.000 Filme) des reifen E217-Virions bei physiologischem bzw. basischem pH-Wert gesammelt (Tabelle 1). Bei physiologischem pH-Wert hatten die meisten E217-Virionen einen verlängerten Schwanz von etwa 1500 Å Länge, mit einer DNA-Dichte im Kopf. Der Schwanz, unterteilt in Hals, Scheide und Grundplatte, wies in allen Komponenten eine ausgezeichnete Dichte auf. Im Gegensatz dazu löste der basische pH-Wert eine irreversible Schwanzkontraktion und einen Genomauswurf aus (ergänzende Abbildung 1a). Wir haben den E217-Kopf mithilfe einer alokalisierten Rekonstruktion mit auferlegter fünffacher Symmetrie (C5) rekonstruiert, die eine Auflösung von 2,8 Å bei einem Cut-off der Fourier-Shell-Korrelation (FSC) von 0,143 ergab. Wir haben auch alle Komponenten, die von der ikosaedrischen Symmetrie abweichen9, mithilfe einer lokalen Rekonstruktion29 (ergänzende Abbildung 1b) und einer lokalen Symmetriemittelung visualisiert, was eine Auflösung von 3,3 Å für den Hals, 3,1 Å für die Hülle und 3,4 Å für die Grundplatte ergab (ergänzende Abbildung 1c). , bei FSC0,143. Die hochwertigen Elektronendichten ermöglichten uns die Erstellung von De-novo-Modellen aller Komponenten im Phagenhals, in der Hülle und in der Grundplatte, einschließlich des distalsten Bereichs der Schwanzfasern. Insgesamt haben wir 19 neue Polypeptidketten aufgebaut (ergänzende Abbildung 2), die im realen Raum auf einen endgültigen Korrelationskoeffizienten (CC) von ~ 0,70 bis 0,88 verfeinert wurden, was auf eine hervorragende Modell-zu-Karte-Anpassung hinweist (Tabelle 1). Die Behandlung mit alkalischem pH-Wert löste in vitro eine Kontraktion der Hülle aus22, wodurch etwa 500 Å des Endrohrs freigelegt wurden (Abb. 1b), obwohl die Auflösung der kontrahierten leeren Partikel ohne DNA auf 4,5 Å begrenzt war. Abbildung 1a, b zeigt zusammengesetzte Rekonstruktionen des E217, wobei der verlängerte und kontrahierte Schwanz die Konformation vor und nach dem Auswurf darstellt, die durch Kombination verschiedener Kryo-EM-Karten erhalten wurde (z. B. C5-Kapsid: EMD-29406; C6-Hals: EMD-29487; C6 erweitert: EMD-29481; C6 zusammengezogene Hülle: EMD-29486; C3-Grundplatte: EMD-28405).

Zusammengesetzte Kryo-EM-Rekonstruktionen des E217-Virions bei neutralem pH-Wert (a) und nach Inkubation bei alkalischem pH-Wert (b). c Vergrößerte Ansicht des trimeren Zementierungsproteins gp25, das das ikosaedrische Kapsid dekoriert.

Der E217-Kopf hat einen maximalen Durchmesser von 790 Å und besteht aus 535 Kopien des Hauptkapsidproteins gp25. Wir beziehen uns auf die Rekonstruktion des E217-Virions bei neutralem pH-Wert mit verlängertem Schwanz (Abb. 1a), die mit einer FSC = 0, 143-Auflösung von 2, 8 Å bestimmt wurde (ergänzende Abb. 1c), obwohl im E217 keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden Kopf wegen Alkalisierung. Das E217-Hauptkapsidprotein gp25 nimmt eine kanonische HK97-Faltung30 an (ergänzende Abbildung 3a – c) und ist in einem hexagonalen Gitter mit einer Triangulationszahl T = 931 organisiert. Die ersten 65 Aminosäuren von gp25 waren in der Rekonstruktion nicht sichtbar. Dies deutet darauf hin, dass diese Einheit während der Reifung gespalten werden könnte oder in unserer Rekonstruktion ungeordnet ist. Der Rest von gp25 (Res. 66–382) nimmt eine HK97-Faltung an, die bei einer DALI-Suche32 als dem Hauptkapsidprotein des marinen Siphovirus TW1 (PDB 5WK1 [10.2210/pdb5wk1/pdb])33 am ähnlichsten identifiziert wurde, was nur der Fall ist 10 % identisch mit E217 gp25 in der Aminosäuresequenz. Der RMSD zwischen E217- und TW1-Kapsidproteinen beträgt 8,8 Å für 274 ausgerichtete Cα-Atome von 296 bzw. 317 Cαs (ergänzende Abbildung 3d).

Der Ikosaederkopf E217 ist mit 180 Kopien eines trimeren Proteins, gp24 (Res. 1–211), verziert, das an der dreifachen und quasi-dreifachen Achse des Ikosaeders bindet (Abb. 1a, b) und einen Oberflächenvorsprung erzeugt. Gp24 nimmt eine β-Tulpenfalte34 an (Abb. 1c), wie das Dekorationsprotein gp87 im thermophilen Phagen P74-2635. Jede gp24-Untereinheit besteht aus zwei antiparallelen β-Faltblättern, die wie die Blütenblätter einer Blüte angeordnet sind und eine tulpenartige Struktur bilden. Von jeder Untereinheit geht ein verlängerter N-terminaler Arm (Res. 1–25) aus, der seitlich mit einer Omega-Schleife verpackt ist, die die Reste 58–75 einer benachbarten Untereinheit verbindet (ergänzende Abbildung 4a). Jedes E217-gp24-Trimer kontaktiert drei benachbarte Dekorationsproteine ​​und sechs Kapsidprotein-Untereinheiten in drei benachbarten Kapsomeren und verbirgt so eine Gesamtoberfläche von ~8642 Å2. Gp24-Trimere an benachbarten dreifachen/quasi-dreifachen Achsen erzeugen einen Käfig zwischen den Kapsomeren (ergänzende Abbildung 4b). Die miteinander verbundene Architektur der gp24-Trimere wird durch umfangreiche Van-der-Waals-Kontakte zwischen N-terminalen Armen und Omega-Schleifen stabilisiert.

Ein einzigartiger Penton des E217-Kapsids wird durch das dodekamerische Portalprotein gp19 ersetzt, das einen Befestigungspunkt für den ~1500 Å Schwanzapparat darstellt. Der erste Teil des E217-Schwanzes oder -Halses wurde in einer lokalisierten Rekonstruktion nach Anwendung der C12- oder C6-Rotationsmittelung sichtbar gemacht, was Karten mit einer Auflösung von 3,3 bzw. 3,4 Å (FSC = 0,143) ergab (ergänzende Abbildung 1c). Die C12-Karte wurde verwendet, um De-novo-Modelle des dodekameren Portalproteins gp19 (Res. 97–528 von 765) und des Kopf-Schwanz-Adapters gp27 (Res. 1–155) zu erstellen (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2). Die Dichte unter dem Kopf-Schwanz-Faktor wurde in einer C6-Karte besser aufgelöst, was mit einer Verringerung der Rotationssymmetrie übereinstimmt. Wir identifizierten und erstellten sechs Kopien des Kragenproteins gp28 (Res. 1–132) und des Gateway-Proteins gp29 (Res. 1–183) (Abb. 2a, b und ergänzende Abb. 2).

Schnittansichten des E217-Halsbereichs in den Konformationen vor (a) und nach dem Auswurf (b). Verfeinerte Atommodelle werden mit der Kryo-EM-Dichte überlagert, die bei 3,5 σ Kontur über dem Hintergrund angezeigt wird. c, d Draufsichten auf das Gateway-Hexamer (orange), gebunden an sechs Hüllproteine ​​(lila) in den Konformationen vor/nach dem Auswurf. Die vergrößerten Felder zeigen ein Detail der Gateway:Hülle-Assoziation. Der C-terminale β-Strang Nr. 3 des Gateways (rot gefärbt) bildet ein intermolekulares β-Faltblatt mit der C-terminalen β-Schleife des Hüllproteins (Stränge Nr. 1–2, blau gefärbt).

Das E217-Portalprotein teilt die allgemeine Portalproteinfalte10. Allerdings enthält das E217-Portal, was für eine Myoviridae unerwartet ist, auch einen C-terminalen α-helikalen Zylinder, der in den Kopf hineinragt (Abb. 2a). Die Barrel-Domäne wurde vorhergesagt36 und experimentell in Podoviridae-Phagen wie P2236,37,38 und Sf639 beobachtet, in Myoviridae jedoch nicht gefunden40. Interessanterweise wird der Zylinder nur in der Konformation vor dem Auswurf gefaltet, wenn DNA das Kapsid füllt (Abb. 2a). Die Rekonstruktion vor dem Auswurf ergab auch eine kontinuierliche Dichte, die sich durch das Pfortaderprotein und den Halskanal zieht (Abb. 2a), was mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) übereinstimmt. Im Gegensatz dazu löste die Behandlung mit alkalischem pH-Wert eine E217-Schwanzkontraktion und einen Genomauswurf aus. Unerwarteterweise wurde das Portalproteinfass im Post-Ejection-Zustand aufgrund fehlender Bindungswechselwirkungen mit dsDNA unstrukturiert (Abb. 2b), wie im P22-Prokapsid38. Die Portaldodekamera E217 ist an zwölf Kopien des Kopf-Schwanz-Faktors gp27 angeschlossen, der P22 gp437 sehr ähnelt. Gp27 fügt sich an das Portal an, indem es seinen verlängerten C-terminalen Schwanz an der von zwei Portal-Untereinheiten erzeugten Schnittstelle einfügt, was darauf hindeutet, dass der Kopf-Schwanz-Faktor bei der Bindung oligomerisiert, anstatt als vorgebildeter dodekamerischer Ring zu existieren41.

Die anderen beiden Halsfaktoren, gp28 und gp29, reduzieren die im Portal und von Kopf zu Schwanz gefundene C12-Symmetrie auf das Sechsfache, die im größten Teil des Schwanzapparats erhalten bleibt. Gp28 besteht aus einem kleinen β-Fass, der mit einer markanten N-terminalen α-Helix und zwei seitlichen Verlängerungen (Res. 28–38 und 56–66) verziert ist (ergänzende Abbildung 5a), die ihm das Aussehen eines Pferdesattels verleihen. Unter dem Kopf-Schwanz-Dodecamer sind sechs Kragenproteine ​​gepackt, wobei die gp28-N-Helix orthogonal zu zwei gp27-Untereinheiten positioniert ist, was die Nichtübereinstimmung der C12:C6-Symmetrie erklärt (ergänzende Abbildung 5b). Auf der gegenüberliegenden Seite des gp28-Laufs berühren die Flügel zwei Gateway-Untereinheiten wie ein Sattel, der auf einem Pferd sitzt (ergänzende Abbildung 5b).

Der letzte Halsfaktor, gp29, verbindet den Hals mit dem Hüllengitter (Abb. 2a, b). Gp29 hat eine Sequenzidentität von 10 % mit dem Schwanzterminatorprotein des Phagen Lambda (gpU-D74A), das ebenfalls hexamer ist42. Es stellt zwei Sätze von Kontakten her: An einem Ende sitzt es auf der hexameren Röhre, die durch das Schwanzröhrenprotein gp32 gebildet wird, und erzeugt einen kontinuierlichen β-Faltblattkamm, der das Schwanzlumen begrenzt (unten beschrieben). Andererseits erstrecken sich sechs C-terminale Verlängerungen von gp29 (Res. 172–182) nach außen, um sechs Mantelproteine ​​zu rekrutieren, die seitlich des Gateways positioniert sind (Abb. 2c). Kragen- und Hüllenproteine ​​verbinden sich, indem sie ein intermolekulares dreisträngiges β-Faltblatt bilden. Dieses Sekundärstrukturelement wird durch eine C-terminale β-Schleife im Hüllprotein (β-Stränge Nr. 1 und Nr. 2, Res. 460–488) (Abb. 2c) und eine C-terminale Verlängerung von gp29 (β-Strang Nr. 3, Res. 172–182). Der intermolekulare β-Faltblatt-Brückenkragen und die Hüllenproteine ​​werden im kontrahierten Zustand gehalten, wobei der C-terminale Arm von gp29 um ~25° schwingt, um einer Vergrößerung des Hüllendurchmessers auf 250 Å Rechnung zu tragen (Abb. 2d).

Die E217-Hülle besteht aus 204 Kopien des Schwanzhüllenproteins gp31 (Res. 1–204)43, das 34 abgesteckte hexamere Ringe des Schwanzröhrenproteins gp32 umgibt. Wir haben Kryo-EM-Rekonstruktionen der verlängerten und kontrahierten E217-Hülle mit einer Auflösung von 3,1 Å (FSC = 0,143) ermittelt (ergänzende Abbildung 1c). Veränderungen der Tertiär- und Quartärstruktur des Hüllenproteins gp31 führen zu einer Hüllenkontraktion. Auf der Ebene der Quartärstruktur besteht die erweiterte Konformation der E217-Hülle aus einem helikalen Rohr mit einem Durchmesser von ~205 Å, das eine regelmäßige Steigung von 490 Å und einen Anstieg und eine Drehung von 40,8 Å bzw. 31,3° aufweist (Abb. 3a). Die verlängerte Hülle ist porös und weist sichtbare Öffnungen zwischen den Untereinheiten auf. Das Innenlumen beträgt ca. 75 Å und beherbergt das Endrohr (im nächsten Abschnitt beschrieben). Eine Alkalisierung oder spontane Kontraktion während der Reinigung, die bei etwa 20 % aller Virionen bei neutralem pH-Wert beobachtet wird, löst eine Schwanzkontraktion aus. Dies führt zu einer Kompression der Hülle, wobei die Steigung auf 265 Å abnimmt und der Außendurchmesser auf 250 Å zunimmt, während der Anstieg und die Verdrehung auf 22,1 Å bzw. 30° abnehmen (Abb. 3b). Eine Überlagerung des gestreckten mit dem kontrahierten Zustand zeigt den bemerkenswerten Grad der Hüllenkompression, die 55 % ihrer Länge verliert, um im Durchmesser um 20 % zuzunehmen (Abb. 3c).

Kryo-EM-Rekonstruktionen der kontrahierten (a) und erweiterten (b) Hüllen, berechnet mit einer Auflösung von 3,1 Å bei 0,143 FSC und angezeigt bei 3 σ. c Banddiagramm aller Hüllenuntereinheiten in einer helikalen Ganghöhe von ausgedehnten (lila) gegenüber kontrahierten (cyan) Hüllen. d Überlagerung von Hüllenprotomeren in der gestreckten gegenüber der kontrahierten Konformation. Drei Regionen unterliegen den bedeutendsten Konformationsumlagerungen: der N-terminale Arm (Res. 1–23), die C-terminale β-Schleife (Res. 460–488) und der C-terminale Schwanz (Res. 491–504).

Das Hüllprotein gp31 enthält drei globuläre Domänen, die als A, B und C bezeichnet werden, sowie lange N- und C-terminale Verlängerungsarme (Res. 1–23 und 491–504), die von den Domänen B bzw. C ausgehen (Ergänzung). Abb. 6a). Die E217-Domänen B und C weisen erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit dem R2-Pyocin-Hüllenprotein auf, während Domäne A, die in der kleineren Pyocin-Hülle fehlt, im T4-Hüllenprotein konserviert ist (ergänzende Abbildung 6a). Trotz der ähnlichen Domänenzusammensetzung und Gesamttopologie unterscheiden sich die Hüllproteine ​​E217 und T443 in ihrer Aminosäuresequenz und -struktur erheblich (RMSD ~ 26 Å mit nur 5 ausgerichteten Cα-Atomen von 504 bzw. 479 Cαs) (Ergänzende Abbildung 6b). .

Eine Überlagerung der Sekundärstruktur des E217-Hüllproteins in der gestreckten gegenüber der kontrahierten Konformation (Abb. 3d) ergab, dass die N-terminalen Arme einer erheblichen Bewegung unterliegen, mit einer 80°-Rotation um Rest 24 bei der Kontraktion und einer maximalen Verschiebung von bis zu 20 Å . Eine kleinere Bewegung tritt für den C-terminalen Arm auf, wo sich die Reste 491–504 um ~12° drehen und die β-Windung (Res. 460–488) (Abb. 2c, d) sich um ~8 Å verschiebt. Interessanterweise bestimmen diese drei Einheiten (Abb. 3d) die Anordnung der Hüllenuntereinheiten zu einem Gitter. In der erweiterten Hülle kommen die drei Einheiten aus benachbarten Untereinheiten zusammen und bilden ein intermolekulares viersträngiges β-Faltblatt (Abb. 4a). Insbesondere legt eine Hüllenuntereinheit A die C-terminale β-Schleife (Res. 460–488) frei, die die β-Stränge Nr. 1 und Nr. 2 enthält. Der N-terminale Arm einer benachbarten Hüllenuntereinheit B, der sich über der Ebene der Untereinheit A befindet, stellt den β-Strang Nr. 3 bereit, und der β-Strang Nr. 4 stammt vom C-terminalen Arm einer benachbarten Untereinheit, der sich etwas über der Untereinheit A befindet, aber gedreht ist im Uhrzeigersinn. Bemerkenswert ist, dass dieser vierte Strang kürzer ist, da nur sechs Aminosäuren (Res. 6–12) an der Wasserstoffbrückenbindung in der Hauptkette beteiligt sind und bei Gly14 eine scharfe 90°-Krümmung aufweist. Die Kontraktion der Hülle führt zu einer dramatischen Reorganisation der Quartärstruktur mit einer Drehung des β-Faltblatts um etwa 17° im Uhrzeigersinn und einer Verlängerung des β-Strangs Nr. 4, der nahezu gerade C-terminal von Gly14 wird (Abb. 4a). Dies führt zu einer auffälligen Verdichtung und Kontraktion der Hülle, deren Durchmesser sich vergrößert (Abb. 4b, c), wodurch etwa 500 Å des nackten Schwanzrohrs freigelegt werden (Abb. 1b).

a Vergrößerte Ansicht des intermolekularen β-Faltblatts, das aus drei Hüllproteinen besteht, die als Untereinheiten A, B und C bezeichnet werden. Auf der linken Seite ist die Assoziation im verlängerten Schwanz vor der Kontraktion zu sehen, während auf der rechten Seite dieselbe Sekundärstruktur zu sehen ist Element nach Schwanzkontraktion. In beiden Panels legt Untereinheit A die die β-Schleife überspannenden Reste 460–488 (z. B. β-Stränge Nr. 1 und Nr. 2, rosa gefärbt) frei, die eine Wasserstoffbrücke mit dem C-terminalen β-Strang Nr. 3 (grün) und Untereinheit B bilden Untereinheit C N-terminaler β-Strang #4 (gelb). b Quartärstrukturdarstellung der drei in (a) beschriebenen Hüllenuntereinheiten A, B und C. c Eine Schnittansicht der E217-Hülle im gestreckten und kontrahierten Zustand.

Gestapelte Hexamere des Schwanzröhrenproteins gp32 bilden die zentrale Röhre des E217-Schwanzes. Das Schwanzrohrprotein ist strukturell konserviert und homolog zum Schwanzrohrprotein, das in nicht kontraktilen Schwänzen, bakteriellen Pyocinen und Sekretionssystemen vom Typ VI vorkommt44. Gp32 besteht aus einer klassischen Falte vom β-Sandwich-Typ, die zwei einander zugewandte viersträngige Schichten enthält und von einer langen α-Helix (Res. 67–79) und einer verlängerten β-Windung (Res. 35–56) umgeben ist ( Ergänzende Abbildung 7a). Sechs Kopien von gp32 fügen sich seitlich zusammen und bilden ein hohles Hexamer, dessen Innenlumen einen Durchmesser von etwa 40 Å hat. Die Grenzfläche zwischen gp32-Untereinheiten wird durch 11 Wasserstoffbrücken stabilisiert, von denen sich viele zwischen Resten bilden, die durch die verlängerte β-Schleife freigelegt werden. Der gp32:gp32-Schnittstelle fehlen jedoch hydrophobe Kontakte, was darauf hindeutet, dass das Schwanzröhrenprotein in Lösung ohne andere Schwanzkomponenten Monomer bleiben könnte45. Die Innenfläche der Röhre ist leicht geladen, mit zwei geladenen Flecken, einem positiven, der durch Arg125/Lys127 freigelegt wird, und dem anderen negativen, der durch Asp27 gebildet wird (ergänzende Abbildung 7b).

Die Schnittstelle zwischen Schwanzrohr und Hüllenprotein variiert je nach Zustand der Schwanzkontraktion. Vor dem Auswurf des Genoms kontaktiert jede Schwanzröhren-Untereinheit ein Hüllprotein und erzeugt so eine ausgedehnte Interaktionsoberfläche, die durch zwei Wasserstoffbrückenbindungen, eine Salzbrücke und 99 Van-der-Waals-Kontakte stabilisiert wird (ergänzende Abbildung 7c). Bemerkenswerterweise berühren sich die Untereinheiten der Schwanzscheide im verlängerten Schwanz nicht, sondern sind ausschließlich durch die Verbindung ihrer C-terminalen β-Windungen und N-/C-terminalen Arme verbunden (Abb. 4a, b). Bei der Kontraktion kommen die Schwanzscheidenkörper seitlich in Kontakt und bilden ein viel engeres Gitter, das eine große Menge an Energie freisetzt26. Aufgrund des vergrößerten Durchmessers im kontrahierten Zustand (Abb. 4c) gehen die Untereinheiten der Hülle keine direkten Bindungen mit dem Endrohr ein, dessen einziger Kontaktpunkt die C-terminale Verlängerung des Gateways ist (Abb. 2d).

Wir ermittelten eine lokalisierte Rekonstruktion der verlängerten Grundplatte mit einer Auflösung von 3,4 Å (FSC = 0,143) (Abb. 1a) und eine Rekonstruktion mit niedrigerer Auflösung nach der Kontraktion (Abb. 1b). Wir haben ein vollständiges Atommodell aller Faktoren in der erweiterten Grundplatte erstellt, die aus 11 einzigartigen Proteinen besteht, die in 66 Kopien wiederholt werden. Die Gesamtmasse der Grundplatte beträgt 1,4 MDa ohne die sechs trimeren Schwanzfasern, die von den Keilen der Grundplatte ausgehen. Die Grundplatte wird an der Spitze des Schwanzapparats montiert, wodurch die sich wiederholende Symmetrie des Schwanzrohrs und des Hüllproteins gebrochen wird und eine einzigartige Spitze für die Anheftung des Wirts, die Zelladsorption und den Genomauswurf entsteht. Unsere Strukturanalyse legt nahe, dass die Grundplatte in drei durch Open Reading Frames (ORFs) 36–46 kodierte Unterkomplexe unterteilt werden kann, die sich wahrscheinlich nacheinander zusammensetzen.

Zunächst wird die aus gp36, gp37/gp38, gp41 und gp43 gebildete Grundplattenkappe (Abb. 5a und ergänzende Abb. 2) auf dem repetitiven Endrohr montiert und versiegelt den Genomauswurfkanal. Gp36 (oder Endrohr-B, Res. 1–167) ähnelt dem Endrohr gp32 (RMSD 3,6 Å) und bildet einen hexameren Ring, der konzentrisch zu gp32 ist. Dieser Faktor bietet eine Bindungsoberfläche für drei Kopien des gp37/gp38-Heterodimers (Res. 1–179 bzw. Res. 1–197), die einen dreifach symmetrischen Komplex unter dem gp36-Hexamer erzeugen. Diese Symmetriefehlanpassung ermöglicht die Anlagerung des trimeren gp41 (Res. 1–287), das das Lumen einschränkt und einen Verankerungspunkt für die trimere Schwanzspitze gp43 (Res. 1–221) darstellt, die den Schwanz abdichtet. Die Schwanzspitze von E217 ist wie andere Myorividae-Spitzen und besteht aus einer dreifachen β-Helix-Faltung46, die in der Aminosäuresequenz zu 99 % mit dem zelldurchdringenden Protein ORF41 des Pseudomonas-Phagen SN (PDB 4RU3) identisch ist.

eine 3,4 Å Kryo-EM-Karte mit überlagerten Grundplattenkappenkomponenten, nämlich gp36, gp37/gp38, gp41 und gp43. b Grundplatte wie in (a) mit den zusätzlichen Adapter-Untereinheiten gp33 und gp34 (b) und c Grundplattenmutter, gebildet aus sechs Triplex-Untereinheiten. d Lokalisierte Rekonstruktion einer Schwanzfaser, die an die verlängerte Grundplatte angedockt ist. e Eine vergrößerte Ansicht der trimeren Schwanzfaser gp46 (Auflösung 1–340) wird mit der dreifach gemittelten Dichte überlagert, berechnet mit einer Auflösung von 3,4 Å bei 0,143 FSC und angezeigt bei 4 σ.

Der zweite Proteinsatz in der E217-Grundplatte umfasst die Adapteruntereinheiten gp33 (Res. 1–107) und gp34 (Res. 1–116) (Abb. 5b und ergänzende Abb. 2). Die erste Untereinheit, gp33, bindet die ca. 40 C-terminalen Aminosäuren von gp37 und gp38, die sich nach außen erstrecken, während gp34 den von gp37/gp38 gebildeten β-Faltblatt-Kamm bindet und über gp33 einen hexameren Ring erzeugt. Bemerkenswert ist, dass sowohl gp33 als auch gp34 hexamere Anordnungen bilden, denen Kontakte innerhalb der Untereinheit fehlen, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Proteinen um Adapter und nicht um diskrete Strukturkomponenten der Grundplatte handelt.

Der dritte Unterkomplex in der E217-Grundplatte oder Mutter (Abb. 5c) besteht aus sechs Kopien des Triplex-Komplexes (ergänzende Abb. 8a), die an der Unterseite der Grundplatte rund um den Kappenkomplex montiert werden. Jeder Triplexkomplex besteht aus zwei Konformeren von gp44 (Res. 1–417), die als gp44-a und gp44-b bezeichnet werden, und einem gp45 (Res. 1–504), das etwas größer als gp44 ist (ergänzende Abbildung 8a). Bemerkenswert ist, dass gp44-a und gp44-b das gleiche Protein sind, jedoch in drastisch unterschiedlichen Konformationen, wobei das Konformer gp44-a kugelförmig und gp44-b verlängert ist, wie Perlen an einer Schnur (ergänzende Abbildung 8b). Die Grenzflächenfläche zwischen gp45:gp44-a ist deutlich kleiner als die von gp45:gp44-b (1712,5 Å2 gegenüber 2801,2 Å2), was darauf hindeutet, dass die beiden Konformere aufgrund der intrinsischen Plastizität von gp44 und der unterschiedlichen Bindungskontakte mit gp45 existieren.

Die Grundplattenmutter bietet eine Verankerungsstelle für Schwanzfasern (Abb. 5d), die bei der Kryo-EM-Rekonstruktion des verlängerten Schwanzes eine geringe Dichte aufwiesen. Eine lokale Rekonstruktion der E217-Schwanzfaser ergab jedoch eine Dichte für den N-terminalen Teil der Faser. Die geschätzte Auflösung dieser Dichte war auf 7,3 Å begrenzt (Abb. 5e), was nicht ausreichte, um ein De-novo-Modell zu erstellen. Anschließend haben wir mithilfe von AlphaFold2 (ergänzende Abbildung 9a) ein Vorhersagemodell des trimeren gp46 erstellt. ORF46, das sich unmittelbar nach der Triplex-Untereinheit gp45 befindet, kodiert für ein großes Protein mit 946 Aminosäuren, die E217-Schwanzfaser. Wir passen die vorhergesagte Faser in die Dichte ein (Abb. 5e), wobei die N-terminalen 340 Aminosäuren die Triplex-Untereinheit gp45 kontaktieren, was eine hervorragende Anpassung an die lokalisierte Rekonstruktion (Abb. 5e) ergibt, die wir im realen Raum weiter verbessert haben Raffinesse. Gleichzeitig hatten die gp46-Reste 341–964 aufgrund ihrer Flexibilität keine sichtbare Dichte in der Kryo-EM-Rekonstruktion. Diese Faserregion faltet sich in fünf kugelförmige Domänen, die stark mit Glycinresten angereichert sind (ergänzende Abbildung 9a), die sich wahrscheinlich wie ein Oktopustentakel bewegen.

Die E217-Schwanzfaser bindet an die Triplex-Untereinheit gp45 (ergänzende Abbildung 9b). Die Verbindung zwischen diesen beiden Proteinen ist eng. Eine lange Schleife in gp45, die sich über die Reste 76–123 erstreckt (als gp45-Faserbefestigungsschleife bezeichnet) (Abb. 5c), passt genau an die trimere helikale Schnittstelle, die durch gp46-N-Termini erzeugt wird (ergänzende Abb. 9b), die eine Spirale annimmt Struktur ähnlich der Schwanznadel gp2648. Die bei der Bindung vergrabene Gesamtoberfläche beträgt 1125 Å2 und ist reich an Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kontakten (Ergänzungstabelle 1). Bei neutralem pH-Wert sind die Schwanzfasern abwechselnd nach unten und oben ausgerichtet (Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass die gp45-Faserbefestigungsschleife eine gp46-Rotation ermöglicht.

Der alkalische pH-Wert löst die Kontraktion des E217-Schwanzes und die Dissoziation der Grundplatte in zwei Komponenten aus (Abb. 6a). Die Grundplattenkappen-Untereinheiten gp36, gp37/gp38 und gp41 verbleiben an der distalen Schwanzspitze und verlieren sowohl den Adapterfaktor gp33 als auch den Schwanzspitze gp43 (Abb. 6b). Im Gegensatz dazu bewegt sich die Grundplattenmutter (z. B. die Untereinheiten gp44-a, gp44-b, gp45 und gp46) wie ein Bolzen um eine Mutter entlang des Endrohrs nach oben und ist fest mit dem letzten Ring aus Hüllenproteinen verbunden (Abb. 6c). . Bemerkenswert ist, dass alle sechs Schwanzfasern im zusammengezogenen Zustand nach unten zeigen, während sie im ausgestreckten Zustand abwechselnd nach oben und unten zeigen (Abb. 1a, b).

a Die Dichtekarte der kontrahierten Grundplatte, berechnet bei 5,3 Å, angezeigt bei 2,5 σ. Seine Proteinbestandteile trennen sich in zwei Teile: Die Basisplattenkappe (ohne Schwanzspitze) bleibt unten (b), während sich die Basisplattenmutter (c) mit der zusammengezogenen Hülle nach oben bewegt. Alle Schwanzfasern sind nach der Kontraktion nach unten gerichtet.

Der Vergleich der Strukturen von Triplex-Komplexen in der Grundplattenmutter vor und nach der Kontraktion liefert Hinweise zur Entschlüsselung der Mechanismen der Schwanzkontraktion. Im verlängerten Schwanz (Abb. 7a) stellen gp44-a und gp44-b einen Handshake-Kontakt am Rand der Grundplatte her. Die flexible Pin-Domäne von gp44-a (ergänzende Abbildung 8b) ist um etwa 70 ° von ihrer C-terminalen Domäne gedreht (Abb. 7b), und sechs Pin-Domänen erstrecken sich nach außen in den Kanal, um Kontakt mit der Schwanzspitze herzustellen. Im kontrahierten Zustand hingegen gleiten gp44-a und gp44-b voneinander weg und stellen einen Fingerspitzenkontakt am Rand der Grundplatte her (Abb. 7c). Die Pin-Domäne bewegt sich wiederum um ca. 35° gegen den Uhrzeigersinn (Abb. 7d), faltet sich auf ihre C-terminale Domäne und verliert die Bindungswechselwirkung mit der Schwanzspitze. Die Drehung der Stiftdomänen vom Schwanzrohr weg führt zu einer Lumenausdehnung und einer Freigabe der Schwanzspitze (Abb. 7e). Wie bereits erwähnt, hat die kontrahierte Hülle keinen Kontakt mit dem Endrohr (Abb. 4c), das aufgrund seiner Steifigkeit seine Konformation bei Kontraktion nicht ändert.

a In der erweiterten Konformation stellen benachbarte Triplexkomplexe Handshake-Kontakte mit gp44-a-Pin-Domänen her, die zur Schwanzspitze hin vorstehen. b Die Gp44-a-Pin-Domäne ist etwa 70° von der C-terminalen Domäne entfernt. c In der kontrahierten Konformation stellen benachbarte Triplexkomplexe Fingerspitzenkontakte her, und d gp44-a-Pin-Domänen schwenken von der Schwanzspitze weg und kollabieren auf ihre C-terminalen Domänen. e Schnittansichten der Grundplatte vor (links) und nach (rechts) der Kontraktion der Hülle. Das Zurückziehen der Pin-Domäne führt zu einer Lumenausdehnung und einer Freigabe der Schwanzspitze.

Wir haben einen spontanen PAO1-Mutanten isoliert, der gegen E217 resistent ist und den wir in Abb. 8a als 4a bezeichnet haben. E217 konnte nicht an 4a adsorbieren (Abb. 8b), was darauf hindeutet, dass die 4a-Mutante möglicherweise einen veränderten oder fehlenden Phagenrezeptor aufweist. Da viele bisher charakterisierte Pseudomonas-Phagen das Lipopolysaccharid (LPS) des Wirts als Rezeptor nutzen49,50,51, haben wir das 4a-LPS mittels Gelelektrophorese analysiert. Wir fanden heraus, dass die Banden, die LPS-Spezies entsprechen, die mit dem O-Antigen bedeckt sind und im LPS des Elternstamms PAO1 vorhanden sind (z. B. die Cm- und Cl-Banden in Abb. 8c), im 4a-LPS fehlen (Abb. 8c). . Darüber hinaus beeinträchtigte die Vorinkubation von E217 mit dem aus PAO1 und nicht aus 4a extrahierten LPS die Phageninfektion (Abb. 8d), höchstwahrscheinlich, weil die Phagenrezeptor-bindenden Proteine ​​(RBPs) PAO1-LPS banden und nicht in der Lage waren, mit dem zu interagieren 4a LPS. Insgesamt stimmen diese Daten mit der O-Antigen-Einheit des LPS als E217-Phagenrezeptor überein.

a E217 bildet auf der 4a-Mutante keine Plaques. Reihenverdünnungen (×10) einer E217-Stammlösung wurden auf PAO1 oder 4a repliziert und als Indikatoren verwendet. b E217 (gelber Balken) weist eine fehlerhafte Adsorption an 4a (brauner Balken) auf. Balken stellen Durchschnittswerte (N = 4) mit Standardabweichung dar. ****P < 0,0001, geschätzt mit einem zweiseitigen T-Test, mit P = 7,26E-05. c Der 4a-Mutant hat defektes LPS, dem die Cm- und Cl-Formen fehlen, nämlich das LPS mit mittel- und langkettigem O-Antigen. U, ungedeckeltes LPS; C + 1, LPS, gekappt mit einer einzelnen O-Antigen-Wiederholung63,79. Die Position der MW-Marker ist links in kDa angegeben. d Die Vorinkubation von E217 mit LPS, das aus PAO1 (gelbe Balken), aber nicht aus 4a (braune Balken) extrahiert wurde, beeinträchtigt die Phageninfektion. Balken geben den durchschnittlichen Eop (N = 3) mit Standardabweichung an. Mit denselben Buchstaben gekennzeichnete Balken unterscheiden sich laut ANOVA und Tuckey-Post-hoc-Analyse nicht signifikant (mit F = 18,03179 und P = 3,29E-05). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Domänenannotationsanalyse der E217-Schwanzfaser identifizierte eine N-terminale Kohlenhydratbindungsdomäne (CBD), eine Lektinbindungsdomäne und ein zweites CBD in der Mitte der Faser sowie eine C-terminale α-Amylasedomäne (ergänzende Abbildung 9a). ). CBDs können LPS-Einheiten binden, während die Lektin-bindende Domäne ein mutmaßlicher O-Antigen-bindender Rezeptor ist, wie für R-Typ-Pyocin-Schwanzfasern vorgeschlagen52. Lektin-bindende Domänen enthalten eine Jellyroll-Faltung mit einem variablen distalen Schleifennetzwerk, das an der Bindung an das LPS-O-Antigen beteiligt ist. Im Gegensatz dazu gehört die α-Amylase-Domäne zur Klasse der O-Glycosylhydrolasen, weit verbreitete Enzyme, die die glykosidische Bindung zwischen zwei oder mehr Kohlenhydraten oder zwischen einem Kohlenhydrat- und einem Nicht-Kohlenhydrat-Anteil hydrolysieren53, die häufig in den Schwanzspitzen und Schwanzfasern von Podoviridae vorkommt Laktophagen13. Allerdings fehlt der E217-Faser in vitro die LPS-hydrolytische Aktivität.

Infektionen durch den gramnegativen Erreger P.aeruginosa sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Die Phagentherapie gegen P.aeruginosa hat als vielversprechende therapeutische Waffe im Kampf gegen CF-bedingte Infektionen Beachtung gefunden54,55.

E217 ist ein PB1-ähnlicher Phagen, Teil eines experimentellen Phagencocktails zur Ausrottung von P. aeruginosa-Infektionen in vivo1,2,3. In unserer Studie beschreiben wir die atomare Struktur des E217-Phagen, die wir durch die Kombination der Leistungsfähigkeit ikosaedrischer und lokalisierter Rekonstruktionen gelöst haben.

Wir fanden heraus, dass E217 ein ikosaedrisches Kapsid mit T = 9 aufweist, das mit gp24 dekoriert ist, einem wahrscheinlich zementierenden Protein, das das E217-Kapsid stabilisiert56. Wir haben die atomaren Strukturen aller Halskomponenten definiert, nämlich die Kopf-Schwanz-, Kragen- und Gateway-Faktoren, die den Ikosaederkopf mit dem kontraktilen Schwanz verbinden. Durch den Vergleich verlängerter und kontrahierter Schwänze haben wir festgestellt, dass der Hals aufgrund der Kontraktion keine globalen Konformationsänderungen erfährt, mit Ausnahme des Portalzylinders, der nach dem Auswurf des Genoms verschwindet, und der C-terminalen Gateway-Verlängerung, die sich dreht, um eine Kontraktion der Hülle zu ermöglichen. Wir haben die tertiäre und quartäre Anordnung des E217-Hüllproteins entschlüsselt, das ein komplexes intermolekulares Netz bildet. Das E217-Hüllprotein ähnelt topologisch dem T4-Gegenstück43, das wie E217 gp31 ebenfalls aus drei Domänen besteht. Es unterscheidet sich jedoch erheblich in der Aminosäuresequenz und -struktur, was unterstreicht, wie eine ähnliche Tertiärstruktur in verschiedenen Viren mit minimaler Sequenzidentität konserviert werden kann57. Untereinheiten der Hülle stellen im kontrahierten Zustand umfangreiche seitliche Kontakte her und liefern den energetischen Beitrag, der diese Konformation thermodynamisch stabil macht. Im Gegensatz dazu sind Hüllenuntereinheiten in der erweiterten Konformation porös und werden nur durch ein intermolekulares β-Faltblatt zusammengehalten. Somit erzeugen E217-Hüllenproteine ​​ein vernetztes zweidimensionales Netz mit ähnlicher Konnektivität im ausgedehnten und kontrahierten Zustand der Hülle22,23, jedoch mit unterschiedlicher Topologie und unterschiedlichen Außendurchmessern.

Wir haben die vollständige Architektur der E217-Grundplatte entschlüsselt, die wir in zwei Komplexe rationalisiert haben: einen Leerkappenkomplex, der das distale Ende des Endrohrs abdichtet, und einen beweglichen Komplex, die Mutter, die über die Adapterfaktoren gp33 und gp34 an der Kappe befestigt ist . Interessanterweise sind alle vier Proteine ​​im Kappenkomplex, gp36, gp37, gp38 und gp41, evolutionär mit dem Schwanzrohr verwandt und nehmen eine ähnliche Faltung an, die aus zwei orthogonal gepackten β-Faltblättern besteht, die das innere Lumen des Schwanzes bilden46. Der Symmetrieabfall vom sechsfachen Schwanzrohr zur trimeren Schwanzspitze wird durch den heterodimeren gp37/gp38-Komplex übertragen, der auch die Adapter gp33 und gp34 rekrutiert. Die Grundplattenmutter wird wie eine Krone außerhalb der Kappe montiert und bleibt nach dem Zusammenziehen mit der Hülle verbunden. Die Mutter bewegt sich während der Kontraktion entlang des Schwanzrohrs und verliert dabei den Adapterfaktor gp33, während gleichzeitig die Schwanzspitze gp43 und das virale Genom ausgeworfen werden. Die Plastizität im Triplex-Komplex spiegelt hauptsächlich die gp44-a-Kügelchen-auf-einer-Schnur-Konformation wider, die vor und nach der Kontraktion zwei quasi-äquivalente Konformationen annehmen kann. Diese Beobachtung weitet Caspars und Klugs Prinzip der Quasiäquivalenz31, das für Kapsidproteine ​​gut etabliert ist, effektiv auf einen in Myoviridae konservierten Grundplattenfaktor aus. So wie virale Kapsidproteine ​​lokal ähnliche, aber nicht identische Positionen auf der Kapsidoberfläche einnehmen können, wodurch sich ein einzelnes Protein zu einem ikosaedrischen Käfig schließen kann, bestimmt die Quasiäquivalenz der E217-Triplex-Untereinheit gp44-a zwei Möglichkeiten, das Endrohr zu zementieren.

Die in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse ermöglichen es uns, ein Modell dafür zu formulieren, wie die Bindung von E217 an die Pseudomonas-Oberfläche den Auswurf des Phagengenoms durch das Schwanzrohr auslöst14. Wir stellen uns vier Schritte in diesem Infektionsprozess vor (Abb. 9a).

a Schematische Darstellung von E217, das P.aeruginosa infiziert. Es werden vier vorgeschlagene Infektionsschritte gezeigt. Jeder Schritt wird von unterschiedlichen Konformationen der Schwanzfasern und Konformationsänderungen in der Grundplatte begleitet, die in den unteren Feldern dargestellt sind. b Diagramm der E217-Grundplatte (von unten gesehen) in der erweiterten (links) und kontrahierten (rechts) Konformation, wobei die Position der gp44-a-Pin-Domäne hervorgehoben wird. Schwanzfasern sind violett gefärbt: Hell- und dunkelviolett stellen Schwanzfasern dar, die unter und über der Ebene hervorstehen. Die Bilder wurden mit BioRender.com erstellt.

Schritt 1: Die Schwanzfasern von E217 befinden sich in ständiger Brownscher Bewegung und bewegen sich auf und ab, wie in der Rekonstruktion von E217 mit verlängertem Schwanz zu sehen ist. Im Gegensatz zu T4 verfügt E217 nur über eine Art Schwanzfaser, die wie Perlen auf einer Schnur aufgebaut ist. Schwanzfasern funktionieren wie ein Sondierungsgerät, das stochastisch schwankt, um die Chance zu erhöhen, auf einen Rezeptor zu treffen.

Schritt 2: Die Assoziation einer gp46-Faser mit dem O-Antigen des Wirts über eine Lektinbindungsdomäne (ergänzende Abbildung 9a) führt zur Phagenanheftung an die Wirtsoberfläche. Diese Reduzierung der 3D-Dimensionalität löst eine kooperative Absorptionskaskade aus, bei der andere Fasern nach unten fluktuieren und mit dem LPS des Wirts in Kontakt kommen, wie für T4-Kurzfasern vorgeschlagen19.

Schritt 3: Nachdem sich mindestens zwei Schwanzfasern an der Wirtsoberfläche befestigt haben, wird ein mechanisches Signal von gp46 über die flexible Faserbefestigungsschleife in gp45 an den Triplex-Komplex übertragen (ergänzende Abbildung 9b). Insbesondere führt das seitliche Ziehen von gp45 zu einer Änderung der gp44-a/b-Assoziation vom Händeschütteln zu Fingerspitzenkontakten und zum Zusammenbruch der gp44-a-Pin-Domäne. In der erweiterten metastabilen Konformation stellt die gp44-a-Pin-Domäne schwachen Kontakt mit der Schwanzspitze her (Abb. 9b, links), wodurch die Schwanzspitze im Kappenkomplex gehalten und die erweiterte Hülle stabilisiert wird.

Schritt 4: Nach der Faserbefestigung und dem seitlichen Ziehen von gp45 zieht sich die Pin-Domäne von gp44-a von der Schwanzspitze weg, kollabiert gegen die C-terminale Domäne von gp44-a und zerstört den einzigen Kontaktpunkt zwischen Mutter und Schwanzrohr (Abb. 9b, rechts). Dadurch löst sich die aus sechs Triplexkomplexen bestehende Mutter vom Endrohr und schnappt nach oben wie eine Mutter um einen Bolzen. Die treibende Kraft der Hüllenkontraktion ist die Bildung intermolekularer Bindungen zwischen Hüllenproteinen, die durch Aggregation in einem 3D-Netz Energie freisetzen26. Während die Schwanzfasern am LPS des Wirts verankert sind, ermöglicht die Kontraktion der Hülle dem Phagen, sich näher an die Wirtsoberfläche zu bewegen und mit seinem Schwanzschlauch in das Periplasma einzudringen. Die Wirtsoberfläche ist ein Stator, und da der Mutterkomplex der Grundplatte an Schwanzfasern gebunden ist, führt die Kontraktion der Hülle mit an LPS gebundenen Schwanzfasern dazu, dass das Schwanzrohr wie eine Spritzennadel durch das OM in das Periplasma eingeführt wird. Die Kompression der Hülle wird durch die Art und Weise ermöglicht, wie das Gateway-Protein die erste Schicht der Hüllenproteine ​​festhält und ein stabiles und dennoch flexibles β-Faltblatt bildet, das sich dehnen kann, um die Ausdehnung der Hülle aufzunehmen.

Es bleibt unklar, ob das Schwanzrohr das IM durchdringt und einen Kanal für den Genomauswurf in das Zytoplasma des Wirts bereitstellt, oder ob beim Auswurf der Schwanzspitze durch Fusion des Schwanzrohrs mit der Innenmembran ein vorübergehendes Loch geöffnet wird19. Die Genome von Myoviridae wie E217 sind noch weitgehend unerforscht, und es ist auch möglich, dass diese Phagen Ejektionsproteine58 kodieren, die dem T7-gp16 ähneln und durch das Schwanzrohr ausgestoßen werden, um einen IM-Kanal für den Genomauswurf zu bilden59.

Zusammenfassend haben wir die Architektur und Designprinzipien eines prototypischen PB1-ähnlichen Phagen entschlüsselt, der in einem experimentellen Phagentherapie-Cocktail verwendet wird. Wir gehen davon aus, dass die in dieser Arbeit erläuterten Strukturprinzipien auch in anderen Myoviridae der weit verbreiteten PB1-Familie erhalten bleiben. Die vollständige Struktur und Konformationsdynamik von E217 geben Aufschluss über Pseudomonas-Myo-phagen, die für die Phagentherapie verwendet werden, und vertiefen das Verständnis von Phagen als Biomedizin. Wir gehen davon aus, dass der in diesem Artikel beschriebene 3D-Atlas der E217-Strukturproteine ​​die Kartierung von Resistenzmutationen ermöglichen und die Identifizierung von ORFs in verwandten Pseudomonas-Phagen, die in Phagentherapie-Cocktails verwendet werden, erleichtern wird.

Der P. aeruginosa-Stamm PAO160 wurde bei 37 °C bis zu einer OD600 = 0,5 (etwa 2,5 × 107 KBE ml−1) in Luria-Bouillon (LB) gezüchtet und mit E217-Phage1 (GenBank NC_042079) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,001 infiziert. Das Wachstum setzte sich fort, bis die Zelllyse als Abfall der OD600 festgestellt wurde. Das Lysat wurde 30 Minuten lang bei 37 °C mit 1 µg ml−1 DNase und RNase inkubiert und anschließend 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert. Nach der Filtration des Überstands durch einen 0,45-µm-Filter wurden 58 g L-1 NaCl und 105 g L-1 Polyethylenglykol (PEG) MW 6 K im Überstand gelöst. Die Lösung wurde ca. 16 Stunden bei 4 °C gerührt, bevor die Phagenpartikel 30 Minuten lang bei 20.000 × g bei 4 °C pelletiert wurden. Die Pellets wurden in TN-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8) resuspendiert und die Phagenmischung wurde auf einem Cäsiumchlorid-Stufengradienten von 1,3 bis 1,6 g cm³-1 Cäsiumchlorid von oben nach unten zentrifugiert und gebildet Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen für den Beckman-Rotor SW41. Die Phagenmischung (3 ml) wurde oben auf den Gradienten aufgetragen und die Gradienten wurden 120 Minuten lang bei 4 °C und 100.000 × g in einer Beckmann Optima XE-90-Ultrazentrifuge unter Verwendung eines SW41 zentrifugiert Rotor. Die Phagenbanden, die normalerweise an der Grenzfläche zwischen den Schritten 1,5 g cc−1 und 1/,6 g cc−1 sedimentieren, wurden mit einer Spritze aus den Röhrchen extrahiert, in Polyallomerröhrchen für den SW60-Beckman-Rotor überführt und ca. 30 Minuten zentrifugiert. 16 h bei 150.000 × g in einer Beckmann Optima XE-90 Ultrazentrifuge mit einem SW60-Rotor. Die Phagenbanden wurden wie oben gesammelt und 2x 20 Minuten lang gegen Wasser und dann 16 Stunden lang gegen TN-Puffer dialysiert, durch 0,22-µm-Filter filtriert und bei 4 °C gelagert.

Es wurden der Stamm PAO1 und sein 4a-Derivat, nämlich ein spontaner E217-resistenter Mutant, verwendet. Insgesamt wurden 03 × 109 KBE PAO1 oder 4a 10 Minuten bei 37 °C mit ca. 08 × 103 Plaque-bildende Einheiten (pfu) von E217 in 1 ml LB. Die Bakterienzellen mit adsorbierten Phagen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 × g pelletiert und der freie Phagen im Überstand wurde unter Verwendung von PAO1 als Indikator titriert. Die Adsorptionseffizienz (%) wurde nach der Formel [1-(freier Phagen/Phageninput)] × 100 berechnet.

PAO1- und 4a-Kulturen wurden in 50 ml LB bei 37 °C bis zu einer OD600 = 0,8 gezüchtet und 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert. Das LPS wurde aus Bakterienpellets mit heißem Phenol und Diethylether extrahiert, wie in Lit. beschrieben. 61. Nach der Extraktion wurden die LPS-Proben etwa 20 Stunden lang lyophilisiert, die Pellets wurden gewogen und in TN-Puffer bei 10 mg ml−1 resuspendiert. Das LPS (5 µg) wurde durch 18 % Tricin-SDS-PAGE und anschließende Silberfärbung sichtbar gemacht62,63.

Um die LPS-Bindung zu bewerten, wurden 103 pfu E217 mit 500 µg, 50 µg, 5 µg LPS, extrahiert aus PAO1 oder 4a, inkubiert oder ohne LPS 60 Minuten lang bei 37 °C in einem Endvolumen von 0,15 ml TN-Puffer scheininkubiert . Die Proben wurden mit 0,3 ml PAO1-Übernachtkultur und 2,5 ml Weichagar gemischt und auf eine LB-Agarplatte ausplattiert. Die Effizienz der Ausplattierung (eop) wurde gemessen, indem die Plaques nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C gezählt und auf die Anzahl der Plaques normalisiert wurden, die in scheininkubierten Proben erhalten wurden.

Insgesamt wurden 2,5 µl reife E217-Virionen mit 1 × 1014 Phagen ml-1 auf ein Quantifoil R 2/1-Lochkohlenstoffgitter (EMS) mit 200 Maschen aus Kupfer aufgetragen, das zuvor 60 s lang bei 15 mA unter Verwendung eines easiGlow ( PELCO). Das Gitter wurde 7,5 s lang bei Blotstärke 2 geblottet und sofort in flüssigem Ethan unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (FEI) vitrifiziert. Kryogitter wurden auf einem Thermo Scientific Glacios Kryo-Transmissionselektronenmikroskop untersucht, das mit einem Falcon 4-Detektor ausgestattet war und mit einer TEM-Schnittstelle (Talos v7.x, TEM v7.X, TIA v5.X, FluCam Viewer v7.X) betrieben wurde Thomas-Jefferson-Universität. Für die Datenerfassung wurde die EPU-Software (v2.X) im Modus „Genaue Positionierung“ verwendet. Zur hochauflösenden Datenerfassung wurden mikroskopische Aufnahmen mit einem Titan-Krios-Mikroskop gemacht, das bei 300 kV betrieben und mit einer K3-Direktelektronendetektorkamera (Gatan) in der National Cryo-Electron Microscopy Facility (NCEF) am Frederick National Laboratory, MD, ausgestattet war. Mikroaufnahmen wurden im Zählmodus mit einem Energiefilter mit einer Bildpixelgröße von 1,12 Å, einer nominalen 81.000-fachen Vergrößerung, einer Gesamtdosis von 50 e/Å2, 40 Bildern und einem Defokusbereich von –0,75 bis –1,5 μm aufgenommen. Um die Kontraktion der Hülle auszulösen, wurde Phagen E217 mit 1 × 1014 Phagen ml-1 über Nacht in 0,1 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 11,4) bei 4 °C inkubiert. Das kontrahierte E217 wurde dann gegen PBS-Puffer (pH = 7,5) im Verhältnis 1:1000 über Nacht bei 4 °C dialysiert und in einer Spin-Konzentrationseinheit mit einem Cut-off von 100 kDa konzentriert. Die Vitrifizierungsverfahren für kontrahiertes E217 waren die gleichen wie für E217 bei neutralem pH-Wert, wie oben beschrieben. Hochauflösende Daten für kontrahiertes E217 wurden im National Center for Cryo-EM Access and Training (NCCAT) gesammelt. Weitere Datenerfassungsparameter finden Sie in Tabelle 1.

Mehrbildfilme des nativen Phagen E217 wurden mit MotionCor264 bewegungskorrigiert, was 22.015 mikroskopische Aufnahmen ergab. Die RELION-Implementierung der Bewegungskorrektur wurde auf die Mikroaufnahmen mit der Option dosisgewichteter gemittelter Mikroaufnahmen und der Summe nicht dosisgewichteter Leistungsspektren alle 4 e-/Å2 angewendet. Die CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) wurde mit CTFFIND465 durchgeführt. Nach einer ersten Runde der Referenzauswahl und 2D-Klassifizierung wurden 15.517 Virionpartikel einer referenzfreien Rekonstruktion mit niedriger Auflösung ohne Auferlegung einer Symmetrie unterzogen. Die Partikel wurden dann 3D-klassifiziert in vier Klassen mit auferlegter I4-Symmetrie. Von den vier Klassen hatte eine Klasse mit 15.505 Partikeln die am besten aufgelöste Rekonstruktion und wurde einer automatischen 3D-Verfeinerung unterzogen, um die Partikel fein auszurichten. Die Partikel wurden dann gemäß der I4-Symmetrie unter Verwendung der relion_particle_symmetry_expand-Funktion von RELION erweitert, um die Partikelorientierungen zu entspannen, die in den folgenden lokalisierten Rekonstruktionsschritten verwendet werden sollen. Eine zylindrische Maske (Radius = 150 Å) wurde mit SCIPION 3.066 generiert und dann auf eine Referenzkarte übertragen, die den fünffachen Scheitelpunkt in UCSF Chimera67 abdeckt. Die zylindrische Maske wurde dann für die 3D-Klassifizierung ohne Abtastung ohne Auferlegung einer Symmetrie zur Suche nach dem Schwanz verwendet. Anschließend wurden lokal ausgerichtete Partikel aus zwei Klassen kombiniert und Duplikate entfernt, was 13.257 Partikel ergab. Die ursprüngliche lokalisierte Referenzkarte wurde mithilfe der relion_reconstruct-Funktion von RELION direkt aus einer der Klassen rekonstruiert. Schwanzausgerichtete Partikel wurden weiter automatisch verfeinert, wodurch eine C5- und C6-Symmetrie eingeführt wurde, mit dem Ziel, das Kapsid bzw. den langen Schwanz auszurichten. Die C5/C6-ausgerichteten Partikel wurden einer dritten 3D-Klassifizierung unterzogen, wobei heterogene Partikel auf 10.826 entfernt wurden. Die endgültig ausgerichteten lokalisierten Schwanzpartikel wurden CTF-verfeinert und poliert. Die in dieser Studie vorgestellten Symmetrien der Endrohrkomponenten wurden durch Untersuchung der Elektronendichtekarten und durch Verknüpfung mit früheren Studien an anderen Endrohren der Myoviridae22 und nicht ab initio aus der Analyse der Leistungsspektren der E217-Endrohre abgeleitet.

Um die Grundplatte zu rekonstruieren, haben wir manuell 12.442 Partikel ausgewählt, die die distale Spitze des E217-Schwanzes enthalten, und die Grundplatte mit C6-Symmetrie rekonstruiert. Anschließend wurden eine C6-Symmetrieerweiterung und eine Suche nach C3-Merkmalen für die Grundplatte durchgeführt. Alle Schritte der SPA, einschließlich 2D/3D-Klassifizierung, 3D-Verfeinerung, CTF-Verfeinerung, Partikelpolierung, Nachbearbeitung und Berechnung der lokalen Auflösung, wurden mit RELION 368,69 durchgeführt. Die endgültigen Dichten wurden mit phenix.auto_sharpen70 geschärft. RELION_postprocess68,69 wurde zur Schätzung der lokalen Auflösung verwendet und Zeichnungen von Elektronendichtekarten und Karten mit lokaler Auflösung wurden mit ChimeraX71 erstellt. Kontrahierte Hülle. Um eine hochauflösende Rekonstruktion der kontrahierten E217-Hülle zu erhalten, wurden leere Partikel mit kontrahierten Enden aus 22.714 Filmen ausgewählt, die auf einem 300-kV-Krios/K3 gesammelt und wie oben beschrieben verarbeitet wurden. Nach umfassender Partikelauswahl und 2D-Klassifizierung wurden 10.126 kontrahierte Schwanzpartikel in C6-Symmetrie rekonstruiert.

Alle in diesem Artikel vorgestellten De-novo-Atommodelle mit Ausnahme des N-terminalen Fragments der Schwanzfaser wurden de novo mit Coot72 oder Chimera67 erstellt und mithilfe mehrerer Runden der Starrkörper-, Realraum- und B-Faktor-Verfeinerung mit phenix.real_space_refinement73 verfeinert . Alle endgültigen Modelle wurden mit MolProbity74 validiert (Tabelle 1). Wir verwendeten sechs verschiedene Karten für den Modellaufbau (ergänzende Abbildung 1c): (i) eine 2,8 Å-Karte, kombiniert aus ikosaedrischer und lokalisierter Rekonstruktion des reifen Kopfes, die die atomare Struktur des E217-Kapsid- und Dekorationsproteins enthüllte; (ii) eine 3,3 Å C12-gemittelte lokalisierte Rekonstruktion, die zum Aufbau des dodekamerischen Portalproteins verwendet wurde, das an zwölf Kopien des Kopf-Schwanz-Adapters gebunden war; (iii) eine 3,4 Å C6-gemittelte lokalisierte Rekonstruktion, die zum Erstellen hexamerer Modelle des Kragens, des Gateways und des Endrohrs verwendet wurde; (iv) 3,1 Å C6-Dichten ausgedehnter oder kontrahierter Hüllen, die zur Modellierung von Hüllenproteinen verwendet werden; (v) ein 3,4 Å großes C6/C3 der erweiterten Grundplatte, das die Modellierung aller 66 Polypeptidketten ermöglichte; (vi) ein 4,5 Å C6/C3 der kontrahierten Grundplatte, das zum manuellen Platzieren verschiedener Grundplattenkomponenten verwendet und anschließend mit dem Befehl „fit-into-map“ in Chimera67 und phenix.real_space_refinement73 verfeinert wurde. Schließlich wurden die N-Termini der Schwanzfaser (Res. 1–340) in einer fokussierten asymmetrischen Rekonstruktion modelliert, die aus der erweiterten C6-Symmetriekarte der Grundplatte generiert wurde, wobei eine zylindrische Maske verwendet wurde, die nur eine Schwanzfaser abdeckte. Die Schwanzfaser in voller Länge wurde mit AlphaFold247 in Fragmenten modelliert. Die ersten 340 Aminosäuren wurden manuell in die 3,6 Å fokussierte Rekonstruktion der Schwanzfaser eingefügt und im starren und realen Raum verfeinert, was einen endgültigen CC = 0,84 ergab (Tabelle 1).

Alle Band- und Oberflächendarstellungen wurden mit ChimeraX71 und PyMol75 generiert. Strukturelle Nachbarn wurden mithilfe des DALI-Servers32 identifiziert. Bindungsschnittstellen wurden mit PISA76 und PDBsum77 analysiert, um Bindungswechselwirkungen und interatomare Abstände zu bestimmen. Ergänzende Tabelle 1 enthält eine umfassende Liste von Wechselwirkungen an Grenzflächen mit nicht übereinstimmender Symmetrie. Die Domänenannotation für gp46 wurde mit SMART78 erstellt. RMSD zwischen überlagerten PDBs wurde mit SuperPose Version 1.0 (superpose.wishartlab.com) und Matchmaker in ChimeraX71 berechnet. Das elektrostatische Coulomb-Potenzial wurde mit ChimeraX71 berechnet und mit Oberflächenfärbung angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten für E217-Kapsid:dekorierender Proteinkomplex, Portal:Kopf-zu-Schwanz:Kragen:Gateway-Komplex, erweiterter Mantel:Röhrenkomplex, kontrahierter Mantel, erweiterter Grundplattenkomplex wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 8FRS, 8FVH hinterlegt. 8FUV, 8FVG bzw. 8EON. Die in dieser Studie erstellten Kryo-EM-Dichtekarten wurden in der Datenbank der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangscodes EMD-29406, EMD-29487, EMD-29481, EMD-29486 und EMD-28405 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken den Mitarbeitern von NCEF und NCCAT für ihre Unterstützung bei der Kryo-EM-Datenerfassung. Wir danken Drake Schaefer von der Thomas Jefferson University für seine Unterstützung beim 3D-Druck. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health mit den Zuschüssen R01 GM100888, R35 GM140733 und S10 OD030457 an GC sowie durch den Zuschuss FFC#15/2021 der Fondazione per la ricerca sulla Fibrosi cistica-Associazione Trentina Fibrosi Cistica ODV In ricordo di Pio Nicolini unterstützt Zu FB Research in dieser Veröffentlichung gehören Arbeiten, die am Sidney Kimmel Cancer Center X-ray Crystallography and Molecular Interaction Facility an der Thomas Jefferson University durchgeführt wurden und teilweise durch den National Cancer Institute Cancer Center Support Grant P30 CA56036 unterstützt werden. Ein Teil dieser Arbeiten wurde bei NCEF durchgeführt (unterstützt durch Vertrag 75N91019D00024); NCCAT und das Simons Electron Microscopy Center, unterstützt durch Zuschüsse des NIH (U24 GM129539), der Simons Foundation (SF349247) und der NY State Assembly.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Fenglin Li, Chun-Feng David Hou.

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Thomas Jefferson University, 1020 Locust Street, Philadelphia, PA, 19107, USA

Fenglin Li, Chun-Feng David Hou, Ravi K. Lokareddy, Ruoyu Yang und Gino Cingolani

Abteilung für Biowissenschaften, Universität Mailand, Mailand, Italien

Francesca Forti & Federica Briani

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FL, C.-FDH, RKL, RY und GC führten alle Schritte der Kryo-EM und Strukturanalyse, die Bestimmung von Atomkoordinaten und Karten sowie die Figurenvorbereitung durch. FF und FB reinigten das E217-Virion und vervollständigten die Identifizierung des Wirtsrezeptor-Assays. GC und FB betreuten das Projekt und verfassten die Arbeit. Alle Autoren haben an der Erstellung und Bearbeitung des Manuskripts mitgewirkt.

Korrespondenz mit Federica Briani oder Gino Cingolani.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Alfred Antson und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Li, F., Hou, CF.D., Lokareddy, RK et al. Hochauflösende Kryo-EM-Struktur des Pseudomonas-Bakteriophagen E217. Nat Commun 14, 4052 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39756-z

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Eingegangen: 5. Februar 2023

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 08. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39756-z

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